酸性磷酸酶实验原理说明 1.目的与原理 实验目的: 掌握Comori法的基本原理和方法。观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。 实验原理: 酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基。在pH5.0的环境中,磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的,所以再经过与硫化铵作用,形成棕黑色的硫化铅沉淀,由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。 本实验的技术特点是: (1)采用冷冻涂片和中性福尔马林固定,可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活,保证了实验的稳定性。 (2)采用较短的作用时间,可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象,保证了实验的可靠性。 (3)以姬姆萨淡染的巨噬细胞为观察对象,细胞核及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰,有助于深入理解细胞吞噬作用、溶酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质等理论问题。 2.实验用品 材料: 小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)。 试剂: (1).10%中性福尔马林(pH6.8~7.1)甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g (2).酸性磷酸酶作用液 蒸馏水 90ml 0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml 5%* 2ml (3).2%β—甘油磷酸钠 4ml 先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合,随后分成大致相等的两份,一份中加*溶液,另一份加甘油磷酸钠溶液,然后再将两者缓缓混合,边混边搅匀后若酸碱度值不到pH5.0,可加少量醋酸的调整。此作用液在临用前配制,不能贮存。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀,否则将严重影响实验结果。 (4).1%硫化胺溶液硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml (5).姬姆萨染液(1:30)姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液(pH6.8) 5ml (6).6%淀粉肉汤牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml 高压灭菌9.9×104pa(15磅)20min,再加入可溶性淀粉6g,水温浴,促使溶解后置冰箱保存备用。 3.实验方法 (1).取小白鼠一只,每日腹腔注射6%淀粉肉汤1ml,连续注射三天。 (2). 在第三天注射后3~4h,再向腹腔注射生理盐水1ml,过3min后在原注射部位抽取腹腔液0.1~0.2ml。请注意!注射和抽液的进针部位和深度要保持一致。否则可能抽不出腹腔液。 (3).将腹腔液滴在预冷的载玻片上,每片1~2滴,涂片,将玻片垂直插入玻片架,迅速放到冰箱内(4℃),让细胞自行铺展。 (4).30min后,将玻片转入10%中性福尔马林,冰箱内4℃固定30min。 (5).自来水漂洗5min,把水甩干。 (6).转入酸性磷酸酶作用液中,37℃处理30min。 (7).自来水漂洗片刻。 (8).1%硫化胺处理3~5min。 (9). 自来水冲洗,甩干。 (10). 用1∶30的姬姆萨染液染色15min。 (11).自来水冲去染液,用磷酸盐缓冲液临时封片,镜检。 (12).对照实验: 将第3步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min,使酶失活,再进行6~11步的同样实验。 4.实验结果 巨噬细胞的细胞质中,出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内,酸性磷酸酶极为丰富。整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。 |