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研生elisa 销售网点(上海研生实业有限公司) >> 新闻中心 >> 酸性磷酸酶实验原理说明
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酸性磷酸酶实验原理说明

点击次数:966 更新时间:2014-10-08

酸性磷酸酶实验原理说明

1.目的与原理
实验目的:
掌握Comori法的基本原理和方法。观察酸性磷酸酶在细胞内的分布状况。

实验原理:
酸性磷酸酶能分解磷酸脂而释放出磷酸基。在pH5.0的环境中,磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅。但因其是无色的,所以再经过与硫化铵作用,形成棕黑色的硫化铅沉淀,由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。

本实验的技术特点是:
(1)采用冷冻涂片和中性福尔马林固定,可避免在固定、包埋及制片过程中酶的失活,保证了实验的稳定性。

(2)采用较短的作用时间,可避免细胞质内其它蛋白质及核内出现阳性假象,保证了实验的可靠性。

(3)以姬姆萨淡染的巨噬细胞为观察对象,细胞核及细胞轮廓以及细胞质中反应沉淀的颗粒都比较清晰,有助于深入理解细胞吞噬作用、溶酶体功能和分布以及溶酶体标志酶——酸性磷酸酶的性质等理论问题。

2.实验用品
材料:
小鼠腹腔液涂片(重点观察巨噬细胞)。

试剂:
(1).10%中性福尔马林(pH6.8~7.1)甲醛 10ml 蒸馏水 90ml 醋酸钠 2g
(2).酸性磷酸酶作用液 蒸馏水 90ml 0.2mol/L醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml 5%* 2ml
(3).2%β—甘油磷酸钠 4ml 先将蒸馏水和醋酸缓冲液混合,随后分成大致相等的两份,一份中加*溶液,另一份加甘油磷酸钠溶液,然后再将两者缓缓混合,边混边搅匀后若酸碱度值不到pH5.0,可加少量醋酸的调整。此作用液在临用前配制,不能贮存。配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀,否则将严重影响实验结果。

(4).1%硫化胺溶液硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml

(5).姬姆萨染液(1:30)姬姆萨原液 3滴 磷酸盐缓冲液(pH6.8) 5ml

(6).6%淀粉肉汤牛肉膏 0.3g 蛋白胨 1.0g 氯化钠 0.5g 蒸馏水 100ml
高压灭菌9.9×104pa(15磅)20min,再加入可溶性淀粉6g,水温浴,促使溶解后置冰箱保存备用。

3.实验方法

(1).取小白鼠一只,每日腹腔注射6%淀粉肉汤1ml,连续注射三天。
(2). 在第三天注射后3~4h,再向腹腔注射生理盐水1ml,过3min后在原注射部位抽取腹腔液0.1~0.2ml。请注意!注射和抽液的进针部位和深度要保持一致。否则可能抽不出腹腔液。

(3).将腹腔液滴在预冷的载玻片上,每片1~2滴,涂片,将玻片垂直插入玻片架,迅速放到冰箱内(4℃),让细胞自行铺展。

(4).30min后,将玻片转入10%中性福尔马林,冰箱内4℃固定30min。

(5).自来水漂洗5min,把水甩干。

(6).转入酸性磷酸酶作用液中,37℃处理30min。

(7).自来水漂洗片刻。

(8).1%硫化胺处理3~5min。

(9). 自来水冲洗,甩干。

(10). 用1∶30的姬姆萨染液染色15min。

(11).自来水冲去染液,用磷酸盐缓冲液临时封片,镜检。

(12).对照实验:

将第3步的腹腔液涂片置50℃温箱中处理30min,使酶失活,再进行6~11步的同样实验。

4.实验结果

巨噬细胞的细胞质中,出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内,酸性磷酸酶极为丰富。整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。

 

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