ELISA试剂盒发现人骨髓间充质干细胞 ELISA试剂盒构建组织工程骨过程中，天然种子细胞存在各种不足：软骨细胞增殖和传代能力差，第5 代软骨细胞已不具有特异性软骨细胞外基质特征，不能大量扩增构建组织工程软骨组织；利用来源于胚胎组织的干细胞成软骨诱导培养虽取得了一定成功，但存在伦理方面限制；人骨髓间充质干细胞因其具有增殖传代能力强、细胞均一性好以及多向分化潜能等特点，作为创伤缺损和退变修复的组织工程种子细胞逐渐受到重视，在体内不同部位微环境或体外不同诱导因子的作用下，可分化成软骨、骨骼、神经、肌腱和肌肉组织等。 组织工程骨对骨缺损的修复过程包括：种子细胞与支架材料黏附→细胞在局部微环境向特定表型分化→细胞分泌胞外基质参与生物材料降解、新骨生成及破骨活动等。因此，种子细胞必须与材料发生适当的黏附，才能进行迁移、增殖和分化。细胞通过黏附分子与材料附着、交换信号，产生细胞识别，进而迁移定位，并决定细胞的组织特异表型。由上述过程可以看出黏附和定向分化是种子细胞发挥功能的始动阶段和效应阶段的两个重要过程，由此展开对种子细胞的基因修饰，可望解决构筑组织工程骨的关键步骤。 ELISA试剂盒钙黏蛋白11对骨髓间充质干细胞进行基因修饰，可促进细胞的黏附性能。利用核心结合因子α1对骨髓间充质干细胞进行基因修饰，有望实现多能干细胞的成骨定向分化，并在诱导成骨分化的级联效应中发挥重要的信号作用。基于以上考虑，实验拟采用腺病毒作为载体，介导钙黏蛋白11基因和核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞，观察两基因的表达情况。 实验方法：
重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMVCadherin- 11和pAdTrack-CMV-Cbfa1的构建：利用 KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切钙黏蛋白11的全长 cDNA质粒和全长核心结合因子α1基因质粒，并且各自回收目的片段，pAdTrack-CMV质粒经同样的酶切处理使之线性化后，分别与目的基因片段连接，使片段定向克隆至含有相同黏性末端的穿梭质粒上，经转化，筛选阳性克隆后，提取重组质粒经KpnⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，阳性克隆送公司测序。 病毒的同源重组：按照pAdeasy腺病毒系统操作说明， ELISA试剂盒将构建正确的pAdTrack-CMVCadherin- 11 和pAdTrack-CMV-Cbfa1 穿梭质粒用PmeⅠ酶切使之线性化，转化已经含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的大肠杆菌 AdEasier-1感受态细菌，在BJ5183细菌内，超螺旋的pAdEasy-1 与线性化的pAdTrack- CMV-Cadherin-11和pAdTrack- CMV-Cbfa1发生重组，将外源基因整合入腺病毒载体的E1 区。 重组腺病毒质粒pAd-Cadherin-11 和 pAd-Cbfa1的鉴定：按照pAdeasy腺病毒系统操作说明，将同源重组获得细菌克隆进行质粒扩增和提取，利用PCR方法进行鉴定。pAd- Cadherin-11引物：上游：5’- AGC GCT CCAAGC GTG G-3’，下游：5’-CTC CAA TGT CTG GAT CT-3’，扩增约750 bp；pAd-Cbfa1引物：上游：5’-TAA GAA GAG CCA GGC AG-3’，下游：5’-AAC AGA TTC ATC CAT TC-3’，扩增约500 bp；PCR反应结束后凝胶电泳观察结果。
在293细胞内包装重组腺病毒：取液氮冻存的293细胞复苏，ELISA试剂盒接种于含体积分数为10%胎牛血清的Eagle’s MEM常规培养基中，另加100 U/mL青霉素、100 U/mL 链霉素，于37 ℃、体积分数为5%的CO2中恒温恒湿培养。每一两天更换培养基。应用脂质体Lipofectamine 2000转染试剂将PacⅠ酶切线性化的重组腺病毒质粒 pAd-Cadherin-11和pAd-Cbfa1共转染293细胞，转染后 24~48 h用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，腺病毒的产生可以通过其表达的绿色荧光蛋白进行监测。 重组腺病毒的扩增及滴度测定：收集包装后的病毒上清液，取1/2病毒上清重新感染293细胞，四五天后收集细胞，重复冻融方法收集病毒上清，继续感染细胞，如此反复4次进行病毒的大量扩增，以进一步提高滴度。按AdEasy™ XL Adenoviral Vector System 操作说明进行病毒的纯化。滴度测定通过蚀斑分析来确定。 人骨髓间充质干细胞的分离培养：从胸椎骨折患者的健康椎体抽取骨髓10 mL，肝素抗凝后Percoll法密度梯度离心，取中间单核细胞层以低糖DMEM洗涤2次，接种入75 cm2培养瓶，以含体积分数为10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素G钠、100 mg/L硫酸链霉素、0.25 mg/L 两性霉素B的低糖DMEM培养。24 h后换液，弃未贴壁的细胞，ELISA试剂盒剩余贴壁细胞主要是骨髓间充质干细胞[10]。以后每两三天换液，待细胞生长至90%汇合后用胰蛋白酶消化传代。 |
