一、优化流动相组成，抑制非特异性吸附 提高离子强度 在流动相中加入 0.2–0.5 M NaCl，可有效屏蔽蛋白质与填料之间的静电作用，减少可逆吸附导致的峰拖尾和展宽。 推荐配方：20 mM磷酸钠缓冲液 + 0.15–0.5 M NaCl，pH 7.0； 注意避免过高盐浓度引发沉淀或腐蚀系统。 添加竞争性保护剂 加入（0.1–0.5 M） 等惰性氨基酸，作为竞争性分子占据填料表面活性位点，减少蛋白直接接触吸附位点。 调节pH远离等电点 鸡蛋清白蛋白等电点约为pH 4.7，建议将流动相pH控制在 6.8–7.5 范围内，使其带负电荷，增强与流动相的亲和力，降低与固定相的结合倾向。 适量添加有机溶剂 在反相或疏水作用色谱中，可加入 5–20%乙腈削弱疏水相互作用，防止蛋白因疏水区域暴露而吸附。 ⚠️ 不建议超过20%，以免引起蛋白变性。 二、色谱柱预处理与选择 新柱预饱和进样 新色谱柱填料表面活性位点多，易“吃蛋白"。建议先用 含1–2 mg/mL BSA或卵清白蛋白的缓冲液连续进样3–5次，使活性位点被占据，显著提升后续检测的回收率。 选用低吸附性色谱柱 使用 MaxPeak™ Premier色谱柱，其采用改性表面和杂化有机-无机化学设计，能有效阻止分析物与金属表面的相互作用，显著提高蛋白回收率； 或选择 UPLC级高性能SEC柱，具有更均匀的孔结构和更低的非特异性结合风险。 安装保护柱 在主柱前加装 HPLC保护柱，可拦截颗粒物和强吸附性杂质，防止其进入主柱造成污染或不可逆吸附。
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