PCR

聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是指由一对引物介导的基因或克隆的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程，即在一对人工合成的特异性引物介导下，以目的DNA为模板，使用耐热DNA聚合酶，经变性、退火及延伸三个步骤的多次循环，扩增特定DNA片段的过程（其本质是DNA复制）。

添加到反应体系的物质有：

1.待扩增的DNA模板（template）

纯度要高（可通过电泳鉴定）

2.与模板DNA的5`端和3`端序列互补配对的寡聚DNA（即上游引物P1和下游引物P2）（primer）

引物一般设计为20-30bp，合成，合成量一般为2 OD，纯化方式可选用PAGE等方式。

3.反应底物dNTP

使用时注意单位量（10mM还是2.5mM）及推荐使用量。

4.耐热DNA聚合酶（Taq酶）

酶易失效，需要及时分装保存。

5.缓冲溶液（Buffer）

6. PCR水

通常情况下，打开试剂产品（引物，酶等）之前，要注意一下方面：

1． 保存温度

2． 保质期

3． 做适当离心，并做试剂（高浓度）分装，可防止污染浪费、反复冻融并易稀释成其他浓度。分装过程注意防止污染（如采用双蒸水灭菌后分成小管单独保存于冰箱作为PCR水；进行无Nase和RNase处理等等）。

反应体系以20uL-100uL为宜，若选取50uL,则可按照顺序依次加入一下物质：

PCR水   41uL                  38uL

Buffer      5uL                   5uL

P1、P2     各1uL         或     各1uL

dNTP       1uL（10mM）         4uL （2.5mM） 

Taq酶      0.5uL                 0.5uL

zui后加入模板0.5 uL。

注意：1.设置对照组，阴性对照必须有，阳性对照可选。

2．可先配多管的体积，混匀再分装，并可多做一管的反应量，减少误差。

PCR参数的设定:

  99℃预热5min

  94℃变性30s

55℃退火30s       25-35个循环

72℃延伸1min

72℃延伸7min

完成后可在PCR仪作15℃保存。

zui后做琼脂糖凝胶电泳，电泳胶的浓度和体积根据实际需要确定。流程如下：

  琼脂糖+TBE（0.5%）

微波炉中火加热约2.5min，注意不要过度沸腾，导致浓度改变

冷凝至55℃左右（用手感觉温度）

加1-2滴EB（致癌剂，所以整个配胶过程中注意保护自己，仪器，防止污染环境）

倒胶（注意梳子处不要出现气泡，如有则赶至边缘区）

待凝固后即可上样【loading buffer和样品（约10uL）混匀再上，并上Marker】,注意混匀时枪头不要吸进空气，防止产生气泡，上样时枪头应垂直插入上样孔。

电泳（一般160V约30min,注意胶的位置，不要正负极倒置，电源接通后观察铁丝是否有气泡）

电泳完后在紫外灯下观察电泳结果。

注意事项及结果分析：

1． PCR反应的加样量多数是微量的，所以加样时应把枪头伸进液面下加样，并注意确保试剂确实加进去了！

2． 加样过程中注意防止污染样品及试剂。

3． 若PCR反应电泳结果不理想，应及时排除寻找原因。可以按照退火温度，dNTP，引物，酶，模板的顺序来排除查找。