研生试剂-细胞融合 细胞融合的步骤： 1.制备饲养细胞层 一般选择小鼠腹腔巨噬细胞。 与免疫小鼠相同晶系的小鼠，常用BALB／C小鼠，6～10周龄 ↓ 拉颈处死，浸泡在75％乙醇内，3～5min ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液(严禁刺破肠管) ↓ 反复冲洗，吸出冲洗液 ↓ 冲洗液放人10ml离心管，1 200r／min／分离5～6min ↓ 用20％小牛血清或胎牛血清的培养液混悬，调整细胞数至lXl0‘／ml ↓ 加入96孔板，100ul/孔 ↓ 放人37℃C02孵箱培养 2．制备免疫脾细胞 zui后一次加强免疫3d后小鼠拉颈处死 ↓ 无菌取脾脏，培养液洗1次 ↓ 脾脏研碎，过不锈钢筛网 ↓ 离心，细胞用培养液洗2次 ↓ 计数 ↓ 取脾淋巴细胞悬液备用 3．制备骨髓瘤细胞 般选用小鼠腹 ↓ 取对数生长期骨髓瘤细胞离心 ↓ 用无血清培养液洗2次 4.融合 (1)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50m1离心管中用无血清不*培养液洗1次，离心，l 200r／min，8min；弃上清液，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 (2)90s内加入37℃预温的1m1 45％PEG(分子量4 000)溶液，边加边轻摇。37℃水浴作用90s。 (3)加37℃预温的不*培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入lml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。 (4)离心，800r／rain，6min。 (5)弃上清液，用含20％小牛血清HAT选择培养液重悬。 (6)将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孑L板内，每孔加100tzl。一般1个免疫脾脏可接种4块96孔板。 (7)将培养板置37℃、5％CO：培养箱中培养。 细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。然后用培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀释，分置培养板孔中培养。融合过程中有3个问题应特别注意，①细胞比例，骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1：2到1：10不等，常用1：4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4。5ml培养液；间隔2rain滴加5ml培养液，然后加培养液50ml。③培养液的成分，良好的培养液对融合细胞尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。 |
