羊驼肾原代细胞差速消化纯化，核心是利用成纤维细胞贴壁更快、上皮细胞贴壁稍慢的特性，分离得到纯净的肾上皮细胞，具体操作步骤如下： 1. 原代接种后差处理（接种后24小时进行） 取出原代分离后接种24小时的培养瓶，轻轻晃动培养瓶，吸出旧培养基到无菌离心管（悬浮未贴壁的是上皮细胞，成纤维细胞已经贴壁） 将吸出的细胞悬液1000rpm离心5分钟，弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞 将重悬后的细胞转移到新的T25培养瓶，放回培养箱继续培养，完成第一次差分离 2. 传代时重复纯化（每次传代都可操作，3次后纯度可达90%以上） 当细胞汇合度达到70%~80%进行传代，操作如下： 吸出旧培养基，用预温PBS轻轻冲洗一次细胞层 加入少量0.25%，轻轻晃动覆盖细胞层，室温消化1~1.5分钟 轻轻拍打培养瓶侧壁，此时贴壁快的成纤维细胞先脱落，将脱落的细胞悬液吸出丢弃 再次加入新鲜，继续消化2~3分钟，待羊驼肾上皮细胞脱落，加入培养基终止消化 1000rpm离心收集细胞，按常规比例传代，完成本次差速消化纯化 关键注意事项 严格控制第一次消化时间，消化时间过长会导致上皮细胞也提前脱落，达不到纯化效果；时间过短成纤维细胞脱落不，纯度不足 每次差消化都会损失部分细胞，因此接种时保证足够的原代细胞量，避免细胞不足无法传代 纯化3次后，可通过免疫荧光染色（上皮细胞标记物CK18）验证纯度，满足实验需求即可停止纯化。
|
