在实验操作过程中，需特别注意以下几点以确保实验结果的准确性和可重复性： 1. 抗体保存与解冻 - 长期保存应置于-20℃以下环境，避免反复冻融。建议分装后保存，每次使用前置于4℃冰箱缓慢解冻，严禁37℃水浴快速解冻。 - 解冻后的抗体若未用完，应标注开封日期，4℃保存不宜超过1个月。 2. 实验前准备 - 需提前30分钟将抗体从冰箱取出平衡至室温，使用前需12000rpm离心1分钟去除聚集体。 - 建议设置阳性对照（已知表达BRCA的细胞系）和阴性对照（未转染细胞），每次实验需同步进行。 3. 工作浓度优化 - 不同批次抗体需重新进行梯度测试（建议1:100-1:1000稀释），Western Blot推荐初始稀释度为1:500，免疫荧光建议1:200起试。 - 稀释请使用含1% BSA的TBST缓冲液，避免使用含NaN3的稀释液。 4. 实验过程控制 - 抗原修复建议采用pH6.0柠檬酸钠缓冲液高压修复2分钟，避免过度修复导致表位破坏。 - 封闭步骤需使用5%脱脂牛奶室温封闭1小时，二抗孵育时间控制在45-60分钟。 5. 结果判读要点 - 阳性信号应出现在约220kDa位置，需注意排除非特异性条带。建议配合使用BRCA1/2特异性siRNA进行敲除验证。 - 免疫组化结果需在染色后24小时内完成图像采集，避免褪色影响结果分析。
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