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腺病毒的包装，纯化和感染 |
| 点击次数：1724 更新时间：2013-01-08 |
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一、技术背景：
Adeasy系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点，并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1，使之成为较为安全、的病毒载体。利用带有E1基因的293细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并通过CsCl梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100％的感染效率。但需要指出的是Adeasy同样具有所有病毒载体或转染试剂都不可避免的细胞毒性问题。
二、所需试剂：
1.293细胞；
2.重组好的腺病毒质粒；
3.PacI限制性内切酶；
4.质粒回收相关试剂；
5.细胞培养、转染相关试剂；
6.TBS：10mMTris,0.9%NaCl，pH8.1；
7.40%CsCl：28.45gCsCl溶于42.7ml的TBS中，4度保存；
8.15%CsCl：9.085gCsCl溶于47.69ml的TBS中，4度保存；
9.Beckman离心管：14*89mm，SW41转头；
10.Polybrene（sigma），10mg/ml；
11.透析袋：SpectrumCo.（成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属），MW=8000~14400；
12.灭菌甘油。
三、操作流程：
1.293细胞（E1-transformedhumanembryonickidneycells在转染前24小时接种于1或2个60mm培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70%；
2.在转染前，用PacI处理目的质粒（一般一个60mm细胞盘需要6μgDNA）。处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20μl无菌水中；
3.用PEI或其他转染试剂将6μgPacI处理过的质粒转染细胞；
4.8个小时后移去混合液，加入4mlDMEM*培养液（10%CBS，1%Pen/Strep）；
5.在转染后7到10天用细胞刮（而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。离心后将细胞重悬于2.0mlPBS或全培液中。于液氮中冻结细胞，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4次。注意保存时不要反复冻融，可保存于-20℃；
6.将293细胞以50-70%的汇合率铺于60mm培养盘中，以30-50%的体积比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象；
7.在有1/3到1/2的细胞脱离漂浮时，通常是感染后3-5天收集病毒。可进一步通过Westernblot或PCR（5μl病毒上清加上10μlPCR-gradeProteaseK，55℃消化1小时，然后煮沸样品5min，离心后取1-2μl进行PCR反应）证实重组腺病毒的存在；
8.按步骤5的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到107infectiousparticles/ml的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度；
9.为了进一步扩增，将步骤8获得的病毒上清进一步感染100mm培养盘的细胞，按步骤5的方法收集病毒，并进而将其感染150mm细胞培养盘中的293细胞，以获得足够量的病毒；
10.将15%CsCl和40%CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；
11.将zui终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；
12.超速离心，30000rpm，4度离心16个小时；
13.离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用16号针头将这一条带收集；
14.在TBS中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS中透析两次，每次一小时；
15.将纯化的腺病毒分装于EP管中；
16.在EppendorfBiophotometer中测量透析液中的总蛋白量，1μg病毒蛋白相当于4×109病毒颗粒；
17.长期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反复冻溶；
18.由于腺病毒对不同细胞株的感染效率存在差异，且考虑到病毒颗粒的细胞毒副作用，通常通过梯度感染的方法确定所需的病毒用量。以相对细胞数1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒颗粒感染靶细胞；加入相对培养液体积1：1000的Polybrene。在37度下平板离心30分钟；
19.感染8~12小时后换液。将含有病毒的培养液小心移入含有消毒液的废液缸中，加入适量全培液。
详情请看：腺病毒的包装，纯化和感染 |
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