小麦源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒通用原则:
1, 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2, 扩增子的长度应不超过400bp,理想的*能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3, 保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号。
4, 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
5, 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
b),探针设计指导
1,在设计引物之前设计探针
2,探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区。
3,探针的5’端要避免有鸟an酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4,选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6, 探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
7, 检测探针的DNA折叠和二级结构。 MLF, 小鼠淋巴成纤维细胞 mRTEC, 小鼠肾小管上皮细胞 CSC, 小鼠心肌细胞 小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs） MEF, 小鼠胚胎成纤维细胞 MM, 小鼠小胶质细胞 mCF, 小鼠心脏成纤维细胞 MN-c, 小鼠皮质神经元 细胞名称 人绒毛膜毛细血管内皮细胞 人羊膜上皮细胞 人绒毛间充质成纤维细胞 人羊膜间充质基质细胞 人绒毛膜间充质基质细胞 NRK-52E，大鼠肾细胞 H9c2大鼠心肌细胞（ATCC来源） C2C12, 小鼠肌原细胞 NIH/3T3, 小鼠成纤维细胞系 大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs） HSC-T6, 大鼠肝星状细胞系 CHO, 中国仓鼠卵巢细胞系 COS-7L, 非洲绿猴肾成纤维细胞 SF9, 昆虫卵巢细胞 BRL 3A, 大鼠肝正常细胞 HK-2, 人肾皮质近曲小管上皮细胞 HET-1A, 人食管上皮细胞
|
