河豚毒素的检验 摘要 本文介绍了河豚毒素的发现，研究现状，毒理作用，中毒症状以及反向液色谱法，反向离子对液相色谱法，毛细管区带电泳法三种重要的检测方法。 关键词 毒理作用；中毒症状；反向液相色谱法；反向离子对液相色谱法，毛细管带电泳法 0 简介 河豚毒素系日本学者田原良纯1909年首先从河豚鱼中发现,并定名Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ。1950～1957年,横尾晃、津田藤介等人首先从红鳍东方鱼屯,紫色东方鱼屯卵巢中独立地分离到了结晶态的河豚毒素。ＴＴＸ主要存在于河豚鱼类体内,人们原先认为ＴＴＸ是河豚鱼本身的代谢产物或基因产物,但逐渐发现许多其它海生、河生动物如某些蟾蜍、蝾螈、蓝环章鱼等也含有此种毒素,就使这一想法不攻自破。近年来的研究成果表明,ＴＴＸ由细菌产生,经食物链作用传递到动物体内。ＴＴＸ在生物体内一般以微量形式存在,近年来,生物工程技术在海洋生物毒素研究上的应用为获取和制备生物毒素提供了一个简洁可行的途径,某些实验室已用海洋细菌出ＴＴＸ。ＴＴＸ是一种氨基全氢化喹唑啉化合物,分子式为Ｃ11Ｈ17 Ｎ3Ｏ8,分子量为319 28, 其为无臭、易潮解的白色针状结晶。ＴＴＸ易溶于水,部分溶于乙醇和冰醋酸,难溶于脂类溶剂。这两种毒素均在弱酸性条件下稳定,zui适宜ｐＨ值为4～5,对热稳定,煮沸后仍具有活性,但在强酸和碱性条件下不稳定。在碱性条件下,ＴＴＸ可降解为几种喹唑啉化合物。该毒素结构的测定由Ｗｏｏｄ ｗａｒｄ（哈佛大学）、平田和后滕（名古屋大学）及津田小组（东京大学—三共中央研究所）等于1964年分别完成。其结构如图所示： 
1 TTX的毒理作用 ＴＴＸ是通过与钠离子通道受体结合,阻断电压依赖性钠通道,从而阻滞动作电位,导致与之相关的生理活动的阻碍,主要是神经肌肉的麻痹。构效关系研究表明,ＴＴＸ的活性基团是1、2、3位的胍胺基和附近的Ｃ4、Ｃ9、Ｃ10位的羟基,胍氨基在生理ｐＨ条件下发生质子化,形成正电性活性区域,和钠通道受体蛋白的负电性羰基相互作用,阻滞钠离子进入通道。业已证明,钠通道受体至少有6个特异性靶分子结合位点。ＴＴＸ是与钠通道受体部位Ⅰ结合。实验发现,只有当毒素应用于膜外侧时,才能阻止钠离子进入细胞内,对毒素与钠通道更深入的研究显示,毒素受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近。毒素与受体部位结合后,阻止钠离子接近通道的外口,使钠离子不能通过通道进入细胞内,从而使膜不能产生去极化。ＴＴＸ特异性地作用于钠通道,对钾通道、钙通道等其它离子通道无直接影响,对神经肌肉接头的突触及胆碱脂酶也无直接作用,因此它们被作为确定钠通道位置的化学标记物,是研究钠通道的重要工具药。单通道记录结果表明ＴＴＸ阻塞钠离子通道是一种“全或无”的方式,毒素和通道也是1∶1的关系,即一个毒素分子堵塞一个道。毒素分子与受体结合是可逆性的,并受各种阴、阳离子的影响,如Ｎａ+、Ｋ+、Ｍｇ2、Ｃａ2+等带正电荷的阳离子可与毒素竞争受体,ＴＴＸ对钠通道的阻滞具有选择性,只阻滞电压依赖性通道,而且对神经细胞的钠通道敏感性比心肌、骨骼肌上的钠通道要高得多。毒素阻止钠离子内流导致动作电位的阻滞,使动作电位波幅及时程下降,0位相zui大上升速率降低。它们只阻滞动作电位的传导,而对静息电位、静息膜电位和延迟整复等作用不明显。 河豚毒素的检验 2 TTX的中毒症状
ＴＴＸ使中枢呼吸节律减缓,并发现ＴＴＸ对髓部的节律发生有直接和持久的抑制作用,同时观察到膈肌放电减慢,。这些研究表明毒素能透过血脑屏障进入中枢并对中枢产生明显的抑制作用。因此,目前一般认为ＴＴＸ对呼吸和心血管系统的抑制是在中枢和外周共同作用的结果。河豚鱼在我国沿海均有分布。ＴＴＸ在河豚鱼体内分布不均一,主要集中在卵巢和肝脏,肌肉则很少。人多因误食中毒,中毒症状依人和食入毒素的量不同而不同,一般潜伏期短,食用后10ｍｉｎ至15ｈ发病,通常在3ｈ内发病,病情发展迅速。胃肠道症状出现较早,表现为恶心、呕吐、腹泻。局部皮肤麻或刺痛感,首先是口唇、舌尖麻木,继而广泛的肌肉麻痹。咽和喉麻痹,可导致失音。呼吸系统表现为呼吸窘迫,紫绀。心血管系统则出现心律失常,血压下降。患者多感到身体有“飘浮感”。瞳孔开始收缩,后散大。从发病到死亡,多数患者神志清醒。 3 几种主要的检测方法 3.1 反相液相色谱法（HPLC） 3.2 反相离子对-液相色谱法 3.3 毛细管区带电泳法 4 防治措施 4.1 抗体 ＴＴＸ是小分子化合物,只有反应原性,而不具备免疫原性。目前,实验室制备ＴＴＸ抗体均是把ＴＴＸ与大分子血蓝蛋白偶联作为抗原,引发ＢＡＬＢ/Ｃ小鼠的免疫反应。通过这种免疫反应产生的单克隆抗体对毒素具有特异性。体外实验证实,用ＴＴＸ与血蓝蛋白结合物免疫ＢＡＬＢ/Ｃ小鼠产生的抗体能中和ＴＴＸ,抑制ＴＴＸ与钠通道的结合,但对ＴＴＸ派生物及血蓝蛋白均无反应性。ＴＴＸ单抗能有效地拮抗ＴＴＸ对直接电刺激诱发的膈肌收缩和大鼠坐骨神经动作电位的抑制作用,全细胞式钳位记录观察到,当ＴＴＸ使神经细胞瘤细胞钠离子电流*消失后,加入抗体可使电流峰值恢复70%～80%,事先把ＴＴＸ和抗体混合1小时后加入,可使钠离子电流峰值维持在90%,表明ＴＴＸ单抗能有效地拮抗ＴＴＸ对钠离子电流的抑制作用。ＴＴＸ特异性抗体对ＴＴＸ中毒有很好的保护作用,小鼠先尾静脉注入抗体,30ｍｉｎ后再注入ＴＴＸ,小鼠能全部存活,未给抗体组,小鼠全部死亡;若先口服ＴＴＸ,再给抗体,也能*拮抗ＴＴＸ的毒性。抗体对拮抗ＴＴＸ中毒具有较好的作用,但抗体的制备、贮存困难,临床应用受到制约,目前尚无商业性的抗ＴＴＸ免疫球蛋白或单克隆抗体。群众认识河豚鱼,提高对河豚鱼危害性的认识。对麻痹性贝类的预防,要在有污染危险的海域严格执行检疫规则。 4.2 化学药物 ＴＴＸ致死的主要原因是呼吸抑制,因此以前曾用呼吸刺激剂治疗,但无明显效果。zui近,有多个研究报道4-氨基吡啶对ＴＴＸ中毒的拮抗作用。4-氨基吡啶是钾离子通道的阻滞剂,能延缓钾离子内流,延长动作电位,使突触前末梢钙离子内流增多,从而增加突触前乙酰胆碱的释放,增强肌肉收缩能力。另外,4-氨基吡啶还有刺激呼吸作用及中枢兴奋作用。研究报道,豚鼠给予致死剂量的ＴＴＸ,在膈肌收缩出现部分抑制后开始使用呼吸机,于膈肌自主收缩消失后,立即静脉注射4-氨基吡啶,可迅速逆转动物的膈肌收缩抑制、低血压、心率过缓等效应,各指标均能迅速恢复至正常水平甚至更高。但4-氨基吡啶毒副作用大,安全剂量范围小,2ｍｇ/ｋｇ对ＴＴＸ的毒作用具有较好的拮抗效应,只个别动物出现肌颤,4ｍｇ/ｋｇ则所有动物都出现剧烈肌颤,抽搐,而治疗作用没有增强。因此4-氨基吡啶对ＴＴＸ中毒的治疗效果、安全剂量范围都有待进一步研究。 4.3临床治疗 目前临床上对ＴＴＸ中毒尚无药,主要采取综合对症治疗措施。早期可催吐、洗胃,用2%碳酸氢钠中和胃内毒素。活性碳能有效地与毒素结合,有学者推荐洗胃后通过鼻胃管给予活性碳用以中和胃内残*素,抑制毒素的吸收。因ＴＴＸ在碱性条件下不稳定,静脉给与碳酸氢钠可能降低血中ＴＴＸ毒性。出现呼吸困难可气管插管进行机械呼吸。我国一些学者总结临床治疗经验,认为在其他支持疗法的配合下,早期大剂量应用莨菪碱类药物有较好疗效。国外有报道,可逆性胆碱脂酶抑制剂藤喜龙、吡啶斯的明、新斯的明等在ＴＴＸ中毒后能增强肌肉运动能力,可早期使用。但这些药物疗效均无严格的临床对照,目前也没有一种经验性的用药被*是有效的。 5 预防 ＴＴＸ耐热性好,煮沸也不能使其失去活性,因此食用时必须掌握科学方法。另外,在沿海地区要加强宣传,使群众认识河豚鱼,提高对河豚鱼危害性的认识。对麻痹性贝类的预防,要在有污染危险的海域严格执行检疫规则。 |
