人25羟基维生素D3（25（OH）D3）定量检测试剂盒（ELISA）

【试剂盒名称】
人25羟基维生素D3（25（OH）D3）定量检测试剂盒（ELISA）
【试剂盒用途】
定量检测人血清、血浆及相关液体样本中25羟基维生素D3（25（OH）D3）的含量。
【检测原理】
本试剂盒采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA）。将标准品、待测样本加入到预先包被人25羟基维生素D3（25（OH）D3）单克隆抗体透明酶标包被板中，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分，再加入酶标工作液，温育足够时间后，洗涤除去未结合的成分。依次加入底物A、B，底物（TMB）在辣根过氧化物酶（HRP）催化下转化为蓝色产物，在酸的作用下变成黄色，颜色的深浅与样品中人25羟基维生素D3（25（OH）D3）浓度呈正相关，450nm波长下测定OD值，根据标准品和样品的OD值，计算样本中人25羟基维生素D3（25（OH）D3）含量。
【试剂盒组成】
1 酶标包被板 12孔×8条 7 显色剂A液 6mL
2 标准品 0.3mL×6管 8 显色剂B液 6mL
3 20倍浓缩洗涤液 25mL 9 终止液 6mL
4 样本稀释液 6mL 10 说明书 1份
5 特殊稀释液 6mL 11 封板膜 2张
6 酶标试剂 6mL 12 密封袋 1个

备注：标准品（1号→6号）浓度依次为：48、24、12、6、3、1.5μg/L
【需要而未提供的试剂和器材】
1、 37℃恒温箱
2、 标准规格酶标仪
3、 精密移液器及一次性吸头
4、 蒸馏水
5、 一次性试管
6、 吸水纸
【操作步骤】
1、 准备：从冰箱取出试剂盒，室温复温平衡30分钟。
2、 配液：用蒸馏水将20倍浓缩洗涤液稀释成原倍的洗涤液。
3、 加标准品和待测样本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，记录各孔位置，在标准品孔中加入标准品50μL；待测样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL（即样本稀释5倍）；空白对照孔不加。
4、 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
6、 加酶标工作液：每孔加入酶标工作液50μL，空白对照孔不加。
7、 温育：37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
8、 洗板：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板4次（也可用洗板机按说明书操作洗板）。
9、 显色：每孔先加入显色剂A液50μL，再加入显色剂B液50μL，平板混匀器混匀30s（或用手轻轻震荡混匀30s），37℃避光显色15min。
10、 终止：取出酶标板，每孔加终止液50μL，终止反应（颜色由蓝色立转黄色）。
11、 测定：以空白孔调零，在终止后15分钟内，用450nm波长测量各孔的吸光值（OD值）。
12、 计算：根据标准品的浓度及对应的OD值，计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样本的OD值，在回归方程上计算出对应的样品浓度，也可以使用各种应用软件来计算。zui终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数。
【样本要求】
1、 样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2、 样本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能立即试验，可将样本放于－20℃保存，但应避免反复冻融。
3、 样本应充分离心，不得有溶血及颗粒。
【注意事项】
1、 实验严格按照说明书的操作进行，实验结果判定必须以酶标仪读数为准。
2、 酶标包被板开封后如未用完，应立即装入密封袋中加干燥剂保存。
3、 建议所有的标准品、样本和空白对照都做双份检测，取平均值，以减小实验误差。
4、 牢记样本已经稀释5倍，计算结果乘以5才是样本实际浓度。
5、 本试剂盒定量范围为1.5-48μg/L，超过此范围，为标准曲线延伸计算所得，不做为准确定量结果，请用特殊稀释液稀释后测定标准结果（1.5-48μg/L范围内），乘以总稀释倍数即为样本zui终浓度。
6、 若显色过浅，可适当延长底物温育时间。
7、 为避免交叉污染，标准品、样本和空白对照每加一个就要更换一次吸头；酶标工作液、样本稀释液和底物等公共组分，要悬臂加样，不得碰到微孔；不得重复使用封板膜。
8、 试剂盒保质期内使用，不同批号的试剂不得混用。
9、 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。