原代细胞DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法

原代细胞DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法

基本原理：
吖啶橙（acridine orange，AO）是一种常用荧光染料，吖啶橙与原代细胞内的DNA、RNA都有亲和力，但有一定的特异性，即结合后发不同颜色的荧光，DNA呈亮绿色，而RNA呈橘红色至火红色。此法简便快捷，既可染活原代细胞又可染固定原代细胞。用于直接染色观察活原代细胞或固定染色观察原代细胞均可。吖啶橙对活原代细胞毒性小，配成1×10-4—2×10-4可用于直接染色活原代细胞和进行荧光显微镜观察，但不持久，用固定染色观察法效果更好。

材料：
1. 盖片单层培养原代细胞；
2. 固定剂：95%乙醇或乙酸/甲醇（现配）；
3. 吖啶橙：用生理盐水配成1%的干液。使用时再用PBS稀释成1×10-4—2×10-4mol/L pH4.5—5.0的染色液；
4. 0.1mol/L的CaCl2；
5. 1%乙酸；

染色步骤：
1. 将盖片单层培养原代细胞从瓶中取出，立即用温Hanks液漂洗3—5s，以去除培养基中血清；
2. 投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15—30min，用滤纸接触盖片边缘，盖片微干；
3. 用1%乙酸酸化30s；
4. 用1×10-4—2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min；
5. 用0.1mol/L的CaCl2处理30s—2min；
6. PBS漂洗3次，每次数秒；
7. PBS封片，荧光显微镜下直接观察并拍照；
8. 注意事项：观察中应随时填加PBS以避免标本干涸。如用油浸镜观察，需再覆以大盖片盖在附有原代细胞盖片上，保证原代细胞面朝上，用无荧光性油浸镜观察。原代细胞盖片标本在95%乙醇中能保存数日后仍可观察，如退色，再用AO染色。镜下观察，DNA呈翠绿色，RNA呈火红色。

结果：
原代细胞核因含DNA呈绿色，细胞质及核仁因含RNA呈红色；