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质谱在糖蛋白研究中的应用 |
| 点击次数：4063 更新时间：2011-05-24 |
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糖蛋白是蛋白质中的氨基酸侧链被糖基化修饰后的蛋白质，广泛存在于生物体中，具有特殊的生物学功能。研究糖蛋白的传统方法一般是将糖链切掉并分离纯化后再分别进行研究。采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）——这一软电离生物质谱技术，可直接测定糖蛋白的平均分子量及糖含量，应用蛋白酶切及内切糖苷酶酶切相结合的方法，可确定糖基化位点及糖苷键类型。
一、糖蛋白平均分子量及糖含量的测定：
在糖蛋白MALDI-TOF-MS质谱图上表现为一簇峰，各峰之间约相差一个或几个糖基，同时还出现多电荷峰，有些样品中还含少量不带糖链的蛋白峰。糖蛋白的分子量为这些多重峰的平均值。
从不含糖链的蛋白的分子量可以直接得到糖含量，但因其丰度太小难以准确测定。采用内切糖苷酶F将糖链切除，得到含一个GlcNAc的肽链，肽链与糖蛋白平均分子量之间的差值即为糖链的分子量，糖链的分子量与糖蛋白平均分子量的比值即为糖含量。
二、糖苷键类型及糖基化位点的测定：
糖基化位点的确定，则必须依赖一系列酶切反应的实现来加以证实。一般步骤是：①先将糖蛋白还原烷基化、脱盐，加Glu-c酶切，产物再用内切糖苷酶酶切，含糖肽段峰将出现位移。采用差位酶切法对其进行验证：内切糖苷酶F（Endoglycosidase-F）切断N-糖链中五糖核心区中,两个N-已酰氨基葡萄糖间的内糖苷键，而糖N肽酶F（PNGase-F）切断糖链与天冬酰氨间的糖肽键，两者相差一个N-已酰氨基葡萄糖（194Da）；②凝集素对糖肽的提取：凝集素是一类糖结合蛋白，能专一地识别某一特定结构的单糖或寡糖中特定的糖基序列并与之结合。核糖核酸酶B中的糖链为高甘露糖型，我们选用其特异性吸附凝集素----伴刀豆球蛋白（ConA）对含糖肽段进行提取，并直接进行MALDI-TOF-MS检测，为今后糖肽序列分析及糖链结构分析奠定了基质谱在糖蛋白研究中的应用糖蛋白是蛋白质中的氨基酸侧链被糖基化修饰后的蛋白质，广泛存在于生物体中，具有特殊的生物学功能 |
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