(一)主要实验材料 1．材料生长至80％以上汇合的软骨细胞层。 2．消化液O．25％胰酶溶液和O．02％EDTA溶液的混合液(体积1：1混合)。 3．培养液(pH7．2) 含10％FCS的DMEM培养液，添加维生素C(50mg／L)、L一谷氨酰胺(300mg／L)、青霉素(10万I U／L)、链霉素(100mg／L)。 4．培养皿或培养瓶等器材。 (二)实验方法 1．清洗细胞取生长成层的软骨细胞培养瓶，吸去培养液，用Hanks液清洗一次，除去残余培养液和血清。 2．消化细胞加入约2ml胰酶和EDTA混合消化液(以培养器皿大小而定)，于37℃条件下消化2～3min。当大部分细胞变圆、细胞间隙变大时，加入含血清的培养液以终止消化。 3．收集细胞并计数反复吹吸细胞呈细胞悬液并移人离心管中，1500r／min离心6min。弃去上清液，加入少许含血清的培养液，用旋涡振荡器振荡混匀。然后，加入一定量培养液．进行细胞计数，一般细胞浓度调至0．5～l×106／ml。 4．接种细胞通常按约为2×104／cm2的细胞密度进行接种，将接种后的培养瓶(皿)置于37℃、5%CO2孵箱中培养。 (三)蛄果分析 1．传代后的软骨细胞大约在6h内就可全部贴壁，24h可进入对数生长期而开始快速增殖。根据细胞接种密度不同，一般在3～5d可达到85％以上的汇合状态。 2．传代后的软骨细胞比原代细胞体积略大，第1～3代细胞仍以多角形为主，分散生长．较少聚集成软骨结节。因贴壁速度快，很少见到刚分裂后的圆形细胞。第4代以后的关节软骨细胞增殖能力下降，逐渐出现梭形细胞和长梭形细胞，细胞达到汇合状态的时间也逐断延长。常规培养至第6～8代以后，细胞增殖能力迅速下降，细胞全部转变为长梭形或肥大的不规则形，出现明屁的细胞老化或去分化特征。 (四)注意事项 1．原代软骨细胞容易聚集成结节样生长，传代消化时不易形成单细胞悬液。因此，原代软骨细胞在80％～85％汇合时进行传代，以免接种不均匀。 2．该方法仅适用于软骨细胞的短期培养。培养3～4代以内的软骨细胞可基本保持软骨细胞的生物学特性。如需在体外较长期地维持软骨细胞的功能．则应加入TGF一B等生长因子或采用其他有利于维持软骨细胞分化功能的培养体系，如立体培养、流体静压培养、灌注培养等。 |
