根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术等。近年来又发展了杂交免疫细胞化学技术、双重和多重标记技术等。常用的免疫酶细胞化学技术原理。不同的免疫细胞化学技术有各自*的试剂和方法，但基本技术是相似的，都包括抗体制备、组织材料处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。 1．抗体制备 (1)抗体制备：抗体是免疫细胞化学技术TRY-试剂，应具有高特异性、敏感性及价的单克隆和多克隆抗体。目前国内外市场各种特异性抗体种类繁多，但要定位一种新的抗原物质，自制抗体效果较好。 (2)抗体配制方法(包括抗体贮存液和抗体工作液配制方法)。 1)抗体贮存：获得新抗体后，应根据试剂公司提供的抗体效价将其分装使用，密封后放人一20℃冰箱保存备用。一般可保存1～2年。抗体应避免反复冻融而降低效价。 2)抗体工作液的配制：这是免疫细胞化学方法中zui重要的步骤之一。抗体稀释液的配制：常用0．01mol／L pH7．4 PBS或TBS缓冲液做抗体稀释液。抗体稀释液配制：取0．05mol／L pH7．4 TBS 100ml，加温至60℃，再加入明胶lOOmg，搅拌溶解后，冷却至室温，加入lg牛血清白蛋白BSA和NaN3lO~20mg，溶解过滤分装并4℃保存。 (3)抗体稀释度测定方法：用已知阳性抗原切片，进行免疫染色，将其阳性强度与背景染色强度以“+’’表示，可分为++++、+++、++、+、一，分别代表zui强阳性，强阳性，较强阳性，弱阳性，阴性。 1)直接测定法：用于测定*抗体的稀释度，其他条件稳定可靠。将一抗稀释为1：50、I：100、l：200、1：400、1：500，5个稀释度滴加在阳性抗原切片上，同时设替代和阴性对照。 抗稀释度为l：400时，结果呈强阳性。背景染色减少，其稀释度应为1：400～500之间。将一抗再做1．1420、1：440、1：460、1：480和l：500倍稀释，找出稀释度。 2)棋盘(方阵)测定方法：当测定两种以上抗体的配合稀释时，必须采用此种方法。 一抗l：10OO，二抗1：200接近稀释度．再将一抗做l：600、1：700、1：800、1：900和1：1000倍稀释，即可找出稀释度。 2．组织材料处理组织材料处理是获得免疫细胞化学结果的前提条件，需保证检测细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散及不被破坏。 |
