用热稳定DNA聚合酶扩增目的DNA时．会以一定的频率发生碱基错配。这对高保真要求的DNA扩增来说当然是不利的，但这一现象恰好也提供了一种对特定基因进行随机诱变的可能方法。这种利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行随机诱变的技术就称为易错PCR(error—prone PCR，EP—PCR)。ELISA试剂盒 在PCR技术发展初期，人们就已经注意到它的易错本性。但是，如果想将这种易错本性用于创造突变基因，即便是保真度zui低的TaqDNA聚合酶，在常规的PCR反应条件下，其DNA复制的程度还是太高。 为了降低PCR中DNA复制的度，研究者想出了多种办法。其中zui直接也是zui常用的方法是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加入一定量的Mn 2+(替代天然的辅助因子Mg 2+ )，并同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡(通常是将其中的一种dNTP降至5％～10％)。这样，由于TaqDNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，通常可以达到每千碱基对1个突变左右。另外，还可以加入dITP等脱氧核苷三磷酸类似物来控制错配水平，采用这种方法可以将错配率提高到zui高达每5个碱基对1个突变。当然，错配率并不是越高越好，一般认为，理想的突变频率为每个基因1．5～5个点突变。 从易错PCR的操作过程可以看到，易错 PCR与传统诱变育种技术的zui大差别在于，前者是基因水平上的随机诱变，而后者则是细胞水平上的随机诱变。而且易错PCR一般只产生点突变，因此它产生的突变体在多样性方面尚有一定缺陷。但作为一种能够从单一基因产生丰富的随机突变体的技术，仍得到了广泛的应用。ELISA试剂盒 有时经一次突变的基因很难获得满意的结果．因此又发展了连续策略，通过连续几代的随机突变和筛选积累氨基酸突变，成功地提高酶在非自然环境中活性和对非天然底物的活性。K．Chen等人应用随机突变以提高枯草杆菌蛋白酶E在非自然环境——高浓度有机溶剂二甲基甲酰胺(DMF)中的活力。通过连续多轮突变后，筛选得到突变体PC3。PC3与野生酶相比，在60％二甲基甲酰胺溶液中对多肽底物的水解活性提高了256倍。同时，带有不同的氨基酸置换组合的枯草杆菌蛋白酶PC3和其他突变体在二甲基甲酰胺和其他有机溶剂中能有效地催化转酯作用和肽链的合成。ELISA试剂盒 |
