(一)杂交瘤阳性克隆的筛选 并非所有的杂交瘤细胞都能分泌针对目的抗原的特异性McAb，因此必须通过可靠、简便、快速的方法进行筛选和克隆化。杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。具体方法依抗原性质及抗体类型而定。常用的方法有ELISA法、间接血凝试验、放射免疫测定、直接和间接荧光抗体技术、免疫酶斑点试验等。 (二)克隆化技术 为确保McAb的纯一性及避免其他阴性细胞对其生长的影响，要将阳性的杂交瘤细胞进行单细胞分离培养，产生单克隆杂交瘤细胞，经反复2～3次检测均为阳性的杂交瘤细胞，应尽早进行克隆化培养。常用方法包括有限稀释法(limiting dilution，LD)、软琼脂法、直接挑取法及荧光激活细胞分离仪(FACS)分离法。以LD法zui为常用，效果好、简便。LD法：将细胞再悬浮，收集并计数。按105、104、103、102、101的浓度用RPMI 1640培养液做系列稀释。取一块96孔培养板，预先按每孔 lO3～lO6／10ml*培养液加好饲养细胞，然后加入8～10／ml的低浓度细胞悬液，每孔lOOpl，置37℃，5％CO2培养箱内培养7～lOd，其间尽量少观察。之后，选择单克隆生长的阳性孔再一次进行克隆。一般需要如此反复3～5次，直至达lOO％阳性iL时即可。 一、杂交瘤细胞的冻存与复苏 (一)杂交瘤细胞的冻存 及时冻存原始孔的杂交瘤细胞和每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的，因为在没有建立一个稳定分泌抗体细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞污染、分泌抗体能力丧失等现象。细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚砜的培养基中以一定的缓慢速度下降温度(O℃～一20℃，下降1℃／min；一20℃～一40℃下降2℃／min)，可在一196℃液氮或液氮蒸气中长期保存。也可以用细胞冻存装置进行冻存。每种细胞株至少冻存5～10管。 (二)杂交瘤细胞的复苏 将杂交瘤细胞的冻存管从液氮罐里取出，立即投入37℃水浴中，待细胞悬液快速解冻后，立即将细胞用RPMI 1640培养液清洗2次，然后用RPMI 1640*培养液配成细胞悬液滴人24孔培养板或25ml培养瓶中，置37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞生长良好时，2～3d传代培养。若冷冻后细胞死亡较多，可加入饲养细胞共同培养，在复苏冷冻细胞前1d，于24孔培养板上每孔加小鼠腹腔巨噬细胞0．5ml(104／ml)。应定期进行复苏，以检查杂交瘤细胞的活性和分泌抗体的稳定性，传代后再冻存。 |
