肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)是一类能引起肿瘤组织出血坏死的细胞因子。TNF可对一些肿瘤细胞或细胞系起杀伤作用。根据这一特点，可利用对TNF敏感的靶细胞测定TNF活性。常用的方法有细胞毒性法和免疫学检测法。 (一)细胞毒性法 该方法是检测TNF对小鼠成纤维细胞株L929或L—M细胞的细胞毒活性，细胞死亡率与TNF活性成正比。用染色法、同位素测定法。 1．染色法 (1)原理：TNF对L929细胞有细胞毒作用。利用染料中性红、结晶紫或MTT可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，测定其OD值，即可反应细胞的存活状态或TNF对L929细胞的杀伤率，通过计算细胞死亡率，并与TNF标准品对照，即可检测待测样品TNF活性单位。 (2)材料 1)待测样品：10% FCS RPMI 1640作倍比稀释至少6个不同稀释度。 2)TNF标准品。 3)L929细胞株。 4)10％FCS RPMI 1640培养液。 5)0．25％结晶紫(溶于20％甲醇中)。 6)枸橼酸钠缓冲液(O．9％枸橼酸钠，0．02 mol／L盐酸，47．5％乙醇)。 7)96孔培养板，酶标仪。 (3)方法 1)在96孔培养板各孔中加 lOO μl含2×lO5／ml细胞悬液，37℃、5％CO2孵箱中培养2～3 h，让细胞贴壁。 2)用RPMI 1640培养液10倍依次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍依次稀释待检样品，每孔加100μl稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3个重复孔。对照孔6个，3个酊性对照孔各加100 μl含4 μg TNF的RPMI 1640培养液，3个阴性对照孔各加100 μl RP—MI 1640培养液。继续培养18~24 h。 3)甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加100 μl 10%甲醇溶液固定细胞30 s。 4)吸去甲醇溶液，每孔加100 μl结晶紫染液，室温中放置20 min。 5)轻轻甩去染色液，用生理盐水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。 6)测定前，每孔加100 μl 33％脱色液，充分振荡后在570 nm处测定吸光度。 (4)结果分析用光吸收度(OD)值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性。 2．同位素法 (1)原理：TNF’对L929细胞有细胞毒作用。若这种细胞先用。H-TdR标记，则被杀伤后3 H—TdR释放至细胞外，因此可以通过测定肿瘤细胞释放3 H-TdR的量来反映TNF的杀伤活性。 (2)材料 1)待测样品：10％FCS．RPMI 1640作倍比稀释至少6个不同稀释度。 2)TNF标准品。 3)L929细胞。 4)10％FCS RPMI 1640。 5)3 H—TdR(O．5 μci／50μl)。 6)放线菌素D(1μg／ml) 7)闪烁液。 8)9999型玻璃纤维滤纸。 9)细胞收集仪。 10)β液闪计数仪。 (3)方法 1)取对数生长期的L929细胞，调整细胞浓度至2×lO6／ml。 2)加入3 H—TdR O．5μci，置37℃、5％C02孵箱中培养2～3 h，摇动30 min／次。 3)用RPMI 1640洗涤2次，每次800 r／min，离心5 min。 4)调整细胞浓度至2～3×105／ml后，加入96孔培养板中，100μl／孔。 5)加入不同稀释度的待测样本及标准品(设三个重复孔)，加入放线菌素D，使放线菌素Dzui终浓度至lμg／ml，用时设放线菌素、*培养基阴性对照和TNF标准品阳性对照37℃、5％C02孵箱中培养24 h。 6)加入3％胰蛋白酶和0．25％DNA酶各10μl／孔，用多头细胞收集器收集样品于9999型玻璃纤维滤纸上，烤干后，进行β计数。 |
