实体组织材料细胞分离是指从动物机体取出相关的组织，包括正常或病变的，借助酶或物理方法将其分散成单个细胞的过程，也称动物组织体外培养。动物组织分离培养起源于19 世纪胚胎学技术的应用，1907年，美国生物学家Harrison采用盖玻片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法将蛙胚的神经组织培养在淋巴液中，保持存活了几周，并观察到细胞突起的生长过程， Harrison成为动物组织体外培养的奠基人。法国学者Carrel于1923年设计了卡氏培养瓶，提 出动物组织培养中无菌操作的重要性，他从鸡胚中获得的心肌组织成功维持了34年。1951 年，Earle发明了体外培养动物细胞的人工合成培养基。1957年，Dulbecco等人采用胰蛋白酶消化处理和液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。随着技术的不断发展，现在动物实体组织材料分离培养已成为很成熟的一种技术。 (1)机械分离法 机械分离法指通过各种物理方法将动物的组织、器官或肿瘤块分离成单个细胞的方法， 常用的方法是用剪刀剪碎、吸管反复吹打或用挤压过滤的方法。 ①切割分离细胞：用剪刀或者手术刀片将组织块处理成几毫米的碎块，然后通过机械力将其制成单细胞悬液的方法。此种方法对细胞损伤比较大，得到的细胞悬液中的死细胞比较多。 ②机械分散：对于纤维组织含量比较少的组织或肿瘤块，可以将组织碎块放到注射器中，然后用活塞将组织块通过针头将其压出；或将组织碎块置于细胞筛上，用钝器(常用注射器活塞)挤压组织块通过细胞筛从而制成单细胞悬液。 (2)消化分离法 消化分离法是将组织或肿瘤块剪碎，然后用酶等生物试剂(一般用0．1％～O．25％的胰蛋白酶)或化学试剂(一般用EDTA)消化处理组织块，使组织块分散从而制成单细胞悬液。此种方法获得的小悬液可以直接用于培养。可以用于体外解离组织的蛋白消化酶有多种，如胰蛋白酶、胶原酶、链蛋白酶等，一般建议消化液中不含Ca 2+和Mg 2+ ，因为这两种离子对酶有一定的抑制作用。选用何种消化酶来进行消化，需要根据消化的组织来决定，有时使用多种酶联合进行消化。 使用酶消化组织块，常用热消化(37 ℃)或冷消化(4℃)两种处理方式。37 ℃消化时，一般处理时间为30 min，可以将消化液放到摇床上，缓慢摇晃，每隔10 min观察消化情况，如果组织块比较紧密，可以适当延长消化处理时间，zui长的可以消化数日。冷消化则是将放有组安块的消化液置于4℃冰箱中消化过夜，此种消化方式不需要摇晃，静止放置即可。 |
