细胞培养技术发展至今，几乎人体内所有的组织细胞均可在体外培养。由于细胞分化和组织的差异，其培养方法及培养条件也不相同。但由于各组织细胞存在共性和共同的需求，培养的条件和基本实验方法则大同小异。为保证细胞培养成功，操作者必须掌握进行细胞培养的技术，包括无菌技术、基本培养技术、细胞冻存复苏技术以及细胞污染的检测、排除技术。 体外培养的细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是培养成功的首要条件。实验者技术操作不规范，会导致污染。因而在一切操作中zui大可能的保证无菌。每一项工作都必须做到有条不紊、*可靠。 一、培养前准备 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。事先做好相关数据的计算。根据实验要求，准备各种所需器材及物品(已灭菌或除菌)、清点无误后将其放置操作场所(生物安全拒、超净台)内，然后进行消毒。上述这些操作可避免开始实验后，因往返取拿物品而增加污染机会。 二、消毒 (一)基本要求 1．培养室的消毒 在细胞培养室，每天都要用O．2％的苯扎溴铵拖洗地面一次(拖布要)。紫外灯照射30～40min灭菌。 2．超净工作台的消毒 (1)实验开始前．超净工作台的台面要用75％的乙醇擦拭，然后用紫外灯照射30min灭菌．并开启无菌操作台风机运转5～10min后，才可开始实验操作。 (2)在超净工作台面消毒时，切勿使培养的细胞和培养所用液体受到紫外线照射，工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。 3． 些操作用具如移液器、废液缸、试管架等先用75％乙醇擦拭后，再置于工作台内紫外线消毒。 4，每次操作只处理一株细胞，以免造成细胞交叉污染；实验结束后，将实验物品及时带出工作台。如需要继续进行下一个实验，则用75％乙醇擦拭无菌操作台面．再让无菌操作台风机运转10min后，才可进行下一个实验操作。 (二)洗手和着装 着装原则上和外科手术相同，要求着装无菌服、帽子、口罩。在超净台工作时，于开始操作前要用75％乙醇消毒手。如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。 (三)火焰消毒 在无菌环境进行细胞培养时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后一切操作都需在火焰近处并经过烧灼进行。 注意事项： 1．金属器械不能在火焰中烧灼的时间过长，以防退火。烧过的金属器械要冷却后才可使用。 2．吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。 3．开启、关闭已经长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞。另外胶塞、塑料培养瓶瓶口过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。 (四)操作步骤 1．操作前用75％的乙醇擦拭超净台面及双手。 2．实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。进行培养时，动作要准确敏捷；不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。 3．为拿取、使用方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的用品放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。 4．工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。 5．培养液不要过早开瓶；用过之后，应立即封闭瓶口直立。手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方。瓶口zui易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。吸取营养液、PBS、细胞悬液及其他各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。容器打开后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用液体，勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。操作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾液把细菌或支原体带人工作台面发生污染。 (五)生物安全 对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心，并选择适当等级的生物安全柜(至少Ⅱ级)。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生；小心有毒性试剂，例如DMSO及TPA等；并避免尖锐物品伤人等。 (六)定期检查 检查CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度、温度及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常，定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜，预滤网(300h／预滤网，3000h／HEPA)。 |
