(一)材料 1．动物及胚胎来源关中黑猪或长白杂猪配种6～9d后，采用腹中线切开术，无菌暴露其子宫角与卵巢，冲洗子宫角，收集胚胎。 2．ES培养液DMEM培养液(含4．5g／L葡萄糖)，补加10％NCS+0．01 mmol／LM2一麓基乙醇+20μg／ml胰岛素+青霉素、链霉素。 3．ES消化液0．25％胰蛋白酶一0．04％EDTA。 4．饲养层细胞PMEF。 5．器具吸管、4孔培养板、3．5 cm玻璃培养皿。 (二)方法 1．将收集的猪胚胎接种于含有PMEF的平皿上，培养液为ES培养液，置37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2孵箱中培养。 2．胚胎固定在一定位置，一端的滋养层细胞附着于饲养层，从附着处向四周铺展，其铺展的过程伴随着细胞的快速增殖。形成ICM。当ICM集落较小时，用细的玻璃针钩ICM集落细胞的一端，将ICM细胞从饲养层表面剥离。猪的ICM形态改为团状、条状和混合状。 3．用0．25％胰蛋白酶一0．04％EDTA消化培养8～9d的ICM细胞，将增殖的ICM离散并移种人新的含有PMEF的4 孔培养板上，培养24~48h后就会出现新的细胞集落。不具胚胎的ICM，所得的集落数目不等。 4．经培养7d后再次传代培养，观察细胞集落出现的情况。此时常出现3种集落。ES样集落：由小而圆的细胞构成。O滋养层细胞集落：细胞间连接紧密，相互连接成一透明的膜状结构，在饲养层表面迅速铺展，边缘有椭圆形细胞，首尾相连，在集落周围形成一圈，并以此为界与周同饲养层细胞相区别。O上皮细胞样集落：此细胞始终呈扁平状，集落周围轮廓不清，与饲养层细胞无明显界限，但细胞较大、胞质较多、胞核较小、核仁不明显。 5．挑取ES克隆，经胰蛋白酶一EDTA消化分离，移种于新的饲养层细胞上继续培养，此时记为*代．以后每4～5d传代1次。 (三)注意事项 1.猪囊胚可吸附在STO细胞株上，但在此饲养层的细胞上猪的ICM不增殖，故分离猪ES应采用PMEF细胞体为饲养层。 2．猪ES的培养通常采用DMEM(高糖)培养液，并加入血清。 3．在培养液中加入胰岛素是因为胰岛至少能促进早期胚胎卵裂速度，并能增加胚胎发育过程中囊胚细胞的有丝分裂和减少细胞死亡，使囊胚细胞数目增加。 |
