细胞的冻存

细胞的冻存
【概述】
    冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的
水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质
浓度增高，pH 值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞
内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细
胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能力代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋
白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内 DNA
也是冷冻时细胞易受损部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造
成 DNA 的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。
    在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损
伤的关键。目前多采用甘油或者二甲基亚砜作为保护剂。这两种物质在深低温冷冻后对细胞
无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的
形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
【用品】
    胰酶、含血清培养基、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（667.83kPa 蒸汽高压消毒）、
吸管、离心管、冻存管
【步骤】
[1] 用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基；
[2] 加入少量 PBS 冲洗二遍， 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，依据传代的方法把细胞
悬液收集于离心管中，离心 1000 rpm，5-8 min；
[3] 小心弃上清液，加入配置好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后将含有
细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中，每个冻存管加液 1-1.5 ml，细胞zui终密度为
（5—10）×106
/ml；
[4] 冻存管封口，做好标记，按照以下程序冻存：4℃，15min--20 min,﹣20℃ 30min--40
min，见细胞悬液结冻后，放入﹣80 ℃冰箱 3h 或过夜，之后置于液氮中。
【注意事项】
[1] 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但选择对
数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率很低。在冻存前一天换 1 次培
养液。
[2] 将标记好并装入冻存管的支架，从液氮容器口缓缓放入，按 1℃/ min 的降温速度，
在 30-40min 时间内使其到达液氮表面。再停 30min 后，直接投入液氮中。
[3] 细胞在冻存后要在短期内复苏 1 次，观察细胞对冻存的适应性。