实验原理
DNA是一切生物细胞的重要组成成分,主要存在于细胞核中。通过研磨和SDS作用破碎细胞;苯酚和可使蛋白质变性,用其混合液(酚::)重复抽提,使蛋白质变性,然后离心除去变性蛋白质;RNase降解RNA,从而得到纯净的DNA分子。
实验步骤 1.组织块解冻,用生理盐水洗去血污,剪取约0.5g组织,放入1.5ml离心管中,剪碎。 2.加入0.45ml TES混匀,再加入50ul SDS(10%),5.0ul蛋白酶K(20mg/ml),充分混匀后,于56°C保温4-6h,每2h摇1次。 3.放置到室温,加入等体积饱和酚(500ul),颠倒混匀,10000r/m,离心10m,分离水相和有机相,小心吸取上层含核酸的水相,到一个新的1.5ml离心管。 4.加入等体积酚::(25:24:1),颠倒混匀,10000r/m,离心10分钟,取上层转移到新的1.5ml离心管中。细胞 5.加入等体积:(24:1),颠倒混匀,10000r/m,离心10分钟,取上层清液到一个新的1.5ml离心管。 6.加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA,观察现象。 7.12000 r/m,离心10分钟,弃乙醇。 8.-20°C保存的75%乙醇洗涤,10000 r/m,离心5分钟,去乙醇,55°C干燥DNA。 9.加入适量TE溶解DNA(具体依DNA的多少而定),-20°C保存备用。
注意事项 1.抽提每一步用力要柔和,防止机械剪切力对DNA的损伤。 2.取上层清液时,注意不要吸起中间的蛋白质层。细胞 3.乙醇漂洗去乙醇时,不要荡起DNA。 4.离心后,不要晃动离心管,拿管要稳,斜面朝外
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