1. 溶液准备： RIPA缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.4 ，150mM NaCl ，1mM EDTA，1%Triton×100，1%去氧胆酸钠，0.1%SDS，1mM PMSF，1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 （ aprotinin ） ， 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 （ leupeptin ） PBS （ pH7.4 ） ：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4 ，50mM NaCl ，2.7mM KCl 1×样品缓冲液：65mM Tris-HCl （ pH8.0 ），10% （ v/v ） 甘油，2.3%（w/v） SDS，0.01% 溴酚蓝，1% DTT 2. 实验程序： 1 ） 用PBS-EDTA或胰蛋白酶水解液收获细胞并计数。 2 ） 按1ml/107个细胞用预冷的RIPA缓冲液来裂解细胞，4℃摇1h。 3 ） 10000g,4℃离心20min，取上清液。 4 ） 用PBS清洗蛋白A/G琼脂糖颗粒两次，用RIPA缓冲液稀释琼脂糖颗粒至浓度为50%。 5 ） 按每50ml颗粒悬浮液需1ml细胞裂解液计算需要裂解液体积，取相应体积数的裂解液在4℃条件下摇10min。10000g，4℃离心10min，将上清转移到新管中。 6 ） 按每5×106 个细胞加0.5ml细胞裂解液，取相应的裂解液到新管中准备免疫共沉淀（IP）反应，每个反应中加入8-15μg抗体，冰上摇3h。 7 ） 加50ml 50%颗粒悬浮液，4℃摇1h。 8 ） 10000g离心15s，弃上清。 9 ） 用1ml RIPA缓冲液洗涤颗粒两次，以除去无特异结合的蛋白，然后用1ml PBS洗涤3次。 10） 60μl样品缓冲液悬浮颗粒，95℃煮沸5min；SDS-PAGE电泳前样品10000g短时离心15s。 |
