非放射性标记原位杂交技术的兴起和发展，为双重标记原位杂交提供了有效的技术途径。在将放射性核素和非放射性物质标记的两种探针结合进行的双重标记原位杂交技术中，常用的放射性核素标记物为35 S，常用的非放射性标记物为生物素。该双重原位杂交技术可分为一步法和二步法两种。抗体
在一步法中，原位杂交反应用两种探针的混合物一次完成，显示杂交信号时，先用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与杂交体上的生物素结合，并用硝基四氮唑(NBT)和5―溴―4―氯―3―吲哚―磷酸盐(BCIP)作为底物显示杂交体上的碱性磷酸酶(或用ABC法显示杂交体上的生物素)或以碱性磷酸酶标记的抗抗体与杂交体上的结合，并用NBT和BCIP显示碱性磷酸酶，标本脱水干燥后再进行放射自显影处理以显示另一靶核酸。一步法的优点是杂交反应一次完成，操作流程较短，同一细胞内的两种信号容易分辨；缺点是放射自显影的阳性信号要比单标时明显减少，碱性磷酸酶或ABC的阳性反应产物有可能会引起核乳胶的化学显影。
在二步法中，先后使用不同的探针进行两次杂交反应，一般先用35 S标记探针进行原位杂交，放射自显影显示*种杂交体后再用生物素标记的探针进行第二次原位杂交，按生物素―亲和素―碱性磷酸酶法(或ABC法)―抗抗体―碱性磷酸酶法显示第二种杂交体。二步法的杂交信号在镜下明显可辨。用放射性核素标记探针进行*次原位杂交的整个操作顺序，包括放射自显影的显影定影过程，不会改变mRNA的结构，也不会影响第二次杂交反应时靶核酸对探针的可及性。二步法的整个操作流程要比一步法长，但它没有一步法中存在的放射性标记信号的丢失，以及碱性磷酸酶(或ABC)阳性反应产物可能引起乳胶化学显影的弊端。
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